关于引物类专升本毕业论文范文,与高粱SSR标记的筛选PCR反应程序的优化相关毕业论文模板

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摘 要 :以BJ-299、Tx622B、W456、忻粱52和Roma 5个高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增以筛选SSR分子标记引物.设计不同的退火温度和扩增程序,对250对SSR引物进行筛选和反应程序的优化.结果表明,250对SSR引物中有223对引物扩增成功,大部分引物的退火温度为55~57 ℃,共筛选出125对在耐盐碱品种BJ-299与盐碱敏感品种Tx622B间表现出多态性的SSR引物.

关 键 词 :高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench];SSR;PCR;引物筛选


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中图分类号:S514;Q943 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2012)17-3869-03

The Screening of SSR Markers for Sorghum bicolor and Optimization of the PCR Procedure

HAN Yun,GAO Jian-ming,SUN Shou-jun,PEI Zhong-you,LUO Feng

(Department of Agronomy, Tianjin Agricultural College,Tianjin 300384, China)

Abstract: Genomic DNA of 5 Sorghum bicolor varieties, BJ-299, Tx622B, W456, Xinliang 52 and Roma, were used as template for screening SSR primers. By adjusting the annealing temperature and amplification procedure, 223 out of 250 pairs of primers were successfully amplified, of which the annealing temperature was mostly 55~57 ℃. 125 SSR markers showed polymorphism between saline alkali resistant variety BJ-299 and saline alkali sensitive variety Tx622B.

Key words: Sorghum bicolor (L.) Moench; SSR; PCR; pri

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近年来,分子标记技术已被广泛应用于动植物基因组和遗传育种等的研究,成为现代分子生物学和遗传学发展的主流[1].其中SSR标记技术具有易于操作、技术简便、重复性和稳定性好等特点,目前在玉米、水稻、大豆和小麦等作物的遗传连锁图谱构建[2-5]、品种鉴定[6]、种子纯度检测[7]、基因定位[8-11]、遗传差异和多样性研究[12-16]等方面得到了广泛应用.高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]是世界上第五大禾谷类作物[17],可作为粮食作物及动物饲料.SSR分子标记在高粱的遗传育种等研究中已有广泛的应用[18,19].Li等[20]已经在高粱10条染色体上物理定位了1 692个SSR标记;Menz等[21]通过物理定位和遗传定位在高粱的10条染色体上定位了202个SSR标记,这些SSR标记为高粱的遗传改良研究奠定了基础.然而这些已报道的SSR的PCR反应条件不一样,因此有必要建立高效通用的SSR反应体系,以提高分析效率.本研究对高粱SSR-PCR反应条件进行优化并进行了SSR引物的筛选,以期为高粱种质资源遗传结构分析和重要农艺性状的QTL定位奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

实验选用3个甜高粱品种W456、Roma和BJ-299(耐盐碱品种)、1个粒用高粱品种忻粱52及1个保持系Tx622B(盐碱敏感品种),均由天津农学院作物遗传育种重点实验室提供.2009年将这些高粱种植于天津农学院实验田,在植株拔节期前后取各单株叶片,液氮速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱中备用.

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用改良的CTAB法从高粱叶片中提取基因组DNA[22],使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的数量与质量,将浓度调整一致后于-20 ℃贮存备用.

1.2.2 SSR引物的选择 采用Premier 5软件对已报道的SSR引物的退火温度等参数进行计算,首先保留退火温度为55~65 ℃、GC含量为40%~60%和目标片段长度不小于120 bp的引物,然后在保证遗传距离比较均匀的前提下,选择等位基因数目多、其他参数较优的引物,共挑选了250对引物用于本实验,其染色体分布及平均物理距离列于表1.引物序列由生工生物工程(上海)有限公司合成.PCR反应体系为15 μL,包括5 ng/μL的DNA模板4 μL、5 U/μL Taq酶 0.1 μL、10×PCR Buffer 1.5 μL、0.75 μmol/L正反向引物各6 μL、10 mmol/μL dNTPs 0.3 μL、超纯水3.1 μL.

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1.2.3 PCR反应程序的优化 由于在进行SSR-PCR扩增时,退火温度(Tm)和扩增程序对结果有较大影响,本研究的优化主要针对这两个因素进行.退火温度设55、57、59、61 ℃ 4个梯度,具体根据已报道的引物退火温度进行设置.总结已报道的PCR反应条件,设计了2个反应程序:①94 ℃预变性4 min;94 ℃变性1 min,Tm退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸6 min.②94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,Tm退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸6 min.首先采用程序①,以BJ-299和Tx622B的基因组DNA为模板进行扩增,使用2.5%琼脂糖凝胶电泳筛选出条带清晰、稳定、单一、明亮的引物,结果不好的引物采用程序②扩增,如有需要再进行个别优化,并对该筛选出的最佳体系进行稳定性检测.然后使用优化后的SSR-PCR反应程序,以5个高粱品种的基因组DNA作为模板进行扩增,采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.参照Bassam等[23],采用6%变性聚丙烯酰胺变性凝胶电泳对耐盐碱品种BJ-299和盐敏感品种Tx622B的扩增产物进行分离检测,在爱普生凝胶扫描仪上进行扫描并保存图像.

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